发酵罐灭菌过程中需要注意哪些事项？

发酵罐灭菌是确保纯种培养的关键环节，操作不当可能导致杂菌污染、设备损坏或培养基成分破坏。以下是灭菌过程中需重点注意的事项，按灭菌前准备、灭菌中操作、灭菌后处理三个阶段展开说明：

一、灭菌前准备：确保设备与物料状态达标

1. 检查设备完整性  

  - 罐体与管路：  

    - 确认罐体无裂缝、焊缝无渗漏（可通过打压测试，如通入0.1 MPa压缩空气，保压30分钟，压力下降＜5%视为合格）；  

    - 管路连接牢固，尤其是蒸汽进口、排气口、接种口等关键部位，避免蒸汽泄漏导致灭菌不彻-底或人员烫伤。  

  - 传感器与阀门：  

    - pH电极、溶氧电极需拆卸或用保护套隔离（避免高温损坏）；  

    - 所有阀门（如进料阀、取样阀）需处于开启状态（除排气阀外），确保蒸汽流通无-死角，尤其是死角区域（如搅拌轴与罐体连接处、喷嘴背侧）。  

2. 培养基预处理  

  - 成分兼容性：  

    - 避免热敏性物质（如葡萄糖、维生素）与易分解物质（如碳酸钙、铵盐）直接混合灭菌，可采用“分消法"：先对糖液单独灭菌（110℃、15分钟），再与其他成分混合；  

    - 高黏度培养基（如含淀粉、蛋白胨）需适当稀释或预搅拌，防止灭菌时形成“固液分层"导致局部灭菌不彻-底。  

  - 装液量控制：  

    - 实罐灭菌时，培养基体积不应超过罐体容积的70%（预留蒸汽上升空间），避免灭菌过程中液体随蒸汽喷出堵塞排气口。  

3. 空气过滤系统检查  

  - 好氧发酵罐灭菌前需确认空气过滤器（0.22 μm滤膜）已灭菌或更换（若为一次性滤器），避免灭菌后空气倒吸时携带杂菌；  

  - 关闭空气进气管路阀门，防止灭菌时蒸汽反冲入空气压缩机。  

二、灭菌中操作：严格控制温度、压力与时间

1. 升温阶段：排除冷空气  

  - 避免“假压"现象：  

    - 灭菌初期需全开排气阀，缓慢通入蒸汽，待罐内冷空气完-全排出（排气口蒸汽呈连续柱状、无白雾）后再关闭排气阀，开始升压升温；  

    - 若未排净冷空气，罐内实际温度会低于压力表对应温度（如0.1 MPa表压下，含空气时实际温度可能仅100℃，而非标准的121℃），导致灭菌不彻-底。  

2. 保温阶段：精准维持灭菌条件  

  - 温度与压力匹配：  

    - 湿热灭菌的标准条件为121℃、0.1 MPa（表压）维持20~30分钟（针对50 L以下罐体），大容积罐体需延长至60分钟以上；  

    - 实时监控罐内温度与压力，确保二者对应（如0.05 MPa对应108℃，0.15 MPa对应128℃），若压力波动超过±0.02 MPa，需调整蒸汽流量。  

  - 搅拌与翻动：  

    - 灭菌过程中可低速开启搅拌（10~20 rpm），推动培养基流动，避免底部沉积固体（如黄豆饼粉）因传热不均导致灭菌死角；  

    - 但需注意：搅拌轴封若为机械密封，高温下可能因润滑油脂挥发导致泄漏，小型罐可手动转动搅拌轴代替。  

3. 避免“培养基焦化"  

  - 灭菌时若蒸汽通入过快，可能导致罐体底部局部过热，培养基中的糖分与蛋白质发生美拉德反应，形成焦糊物（如葡萄糖焦化后生成5-羟甲基糠醛，抑制菌体生长）；  

  - 预防措施：控制蒸汽流速，保持罐内温度上升速率≤3℃/分钟，同时通过罐体夹套或盘管缓慢加热，而非直接通入蒸汽冲击底部。  

三、灭菌后处理：防止二次污染与设备损伤

1. 降压与冷却：控制速率防止倒吸  

  - 缓慢降压：  

    - 灭菌结束后，先关闭蒸汽阀门，待罐内压力自然降至0.05 MPa以下，再缓慢开启排气阀（开度≤50%），避免因压力骤降导致培养基沸腾喷料；  

    - 好氧发酵罐需在压力降至接近零前，提前通入无菌空气（经0.22 μm滤膜过滤），维持罐内正压（0.01~0.03 MPa），防止外界空气倒吸带入杂菌。  

  - 冷却方式选择：  

    - 优先采用夹套或盘管通水冷却（水温≤20℃），避免直接向罐体喷淋冷水（可能导致罐体骤冷变形，尤其玻璃罐易炸裂）；  

    - 冷却过程中需持续监测罐内压力，若压力过低（接近负压），需补充无菌空气或氮气。  

2. 无菌操作衔接  

  - 接种与取样：  

    - 灭菌后所有操作需在火焰保护下进行（如接种时将接种口置于酒精灯火焰旁，快速打开并接入菌种）；  

    - 取样阀需先用75%酒精擦拭，再用火焰灼烧灭菌，取样后立即关闭阀门。  

  - 过滤器与管路维护：  

    - 空气过滤器在灭菌后需检查完整性（如进行气泡点测试：将滤膜浸入乙醇，通入空气，观察气泡产生时的压力是否≥设计值的80%）；  

    - 管路若需拆开（如连接补料泵），接口处需用灭菌纱布包裹，或重新用酒精棉球擦拭灭菌。  

3. 设备清洗与保养  

  - 及时清洗：  

    - 灭菌后若培养基残留罐壁或搅拌桨，需趁热用温水（40~50℃）冲洗（避免冷却后固形物黏附难以清除），再用氢氧化钠溶液（1%~2%）浸泡30分钟，最后用清水冲至中性；  

    - 不锈钢罐体避免使用钢丝球擦洗，以防刮伤表面钝化层，可用尼龙刷或海绵。  

  - 部件检查：  

    - 检查密封垫片（如O型圈）是否因高温老化变形，若有裂纹需及时更换；  

    - 校准温度传感器、压力表（每年至少一次），确保下一批次灭菌参数准确。  

四、特殊场景注意事项

1. 基因工程菌发酵罐  

  - 灭菌前需确认生物安全阀门已开启（如带有双重密封的排气阀），灭菌后排气需经高效过滤器（HEPA）处理，防止工程菌随蒸汽扩散；  

  - 若使用一次性发酵袋，灭菌方式改为辐照灭菌（如钴-60照射），避免蒸汽湿热破坏塑料材质。  

2. 厌氧发酵罐灭菌  

  - 灭菌后需快速建立厌氧环境：通入氮气置换罐内空气（3次以上），使氧气含量＜0.1%（通过氧化还原电位计监测）；  

  - 接种时采用“氮气保护接种法"，通过无菌管路将菌种压入罐内，避免接触空气。  

3. 连续灭菌（连消）系统  

  - 需同步灭菌连消塔、维持罐与换热器，确保各段温度达标（如连消塔出口温度135℃，维持罐停留时间5分钟）；  

  - 灭菌结束后，用无菌水冲洗管路，防止培养基残留滋生嗜热菌（如嗜热脂肪芽孢杆菌）。 

灭菌失败的常见原因与应对

（一）

问题类型：杂菌污染

可能原因：排气不彻-底、滤膜破损、灭菌时间不足

解决措施：重新灭菌，检查滤器完整性，延长保温时间

（二）

问题类型：培养基碳化

可能原因：蒸汽通入过快、底部积料

解决措施：控制升温速率，灭菌前搅拌均匀物料

（三）

问题类型：设备腐蚀/变形

可能原因：高温下密封件老化、骤冷骤热

解决措施：定期更换密封件，采用梯度冷却

（四）

问题类型：传感器失灵

可能原因：灭菌时未拆卸或保护不当

解决措施：灭菌前移除精密传感器，使用耐高温替代探头

发酵罐灭菌需遵循“彻-底性、安全性、经济性"原则，通过标准化操作流程（SOP）与实时监控（如温度曲线记录），将灭菌成功率提升至99%以上，为后续发酵过程奠定基础。