什么发酵罐需要严格的灭菌？主要灭菌方法有哪些？

在发酵工业中，所有涉及纯种培养的发酵罐均需严格灭菌，以防止杂菌污染导致的菌体生长抑制、产物合成受阻或代谢路径改变。以下是需严格灭菌的发酵罐类型及核心灭菌方法：

一、需严格灭菌的发酵罐类型

1. 好氧发酵罐  

  - 典型场景：抗生素（青霉素、红霉素）、氨基酸（谷氨酸）、酶制剂（淀粉酶）发酵。  

  - 灭菌原因：好氧环境适合多数微生物生长，杂菌易通过通气系统、搅拌轴封等侵入，与生产菌竞争营养和氧气，甚至分泌降解酶破坏目标产物（如杂菌产生的β-内酰胺酶可分解青霉素）。  

2. 厌氧发酵罐  

  - 典型场景：有机酸（乳酸、柠檬酸）、丙酮丁醇、沼气发酵。  

  - 灭菌原因：虽为厌氧环境，但部分杂菌（如产酸菌）在低氧条件下仍可繁殖，消耗底物并产生酸性物质，抑制目标菌代谢（如乳酸发酵中污染大肠杆菌会导致pH下降，乳酸得率降低）。  

3. 基因工程菌发酵罐  

  - 典型场景：重组蛋白（胰岛素、干扰素）、基因工程疫苗生产。  

  - 灭菌关键：工程菌常为“营养缺陷型”或携带外源质粒，杂菌可能通过掠夺营养（如必需氨基酸）或分泌抗生素类物质（如细菌素）导致工程菌死亡，甚至引发外源基因泄漏风险。  

4. 细胞培养罐（动物/植物细胞）  

  - 典型场景：单克隆抗体、病毒疫苗（如新-冠疫-苗）生产。  

  - 灭菌特殊性：动物细胞无细胞壁保护，对杂菌（尤其是支原体、真菌）极其敏感，污染后易引发细胞凋亡或代谢紊乱，且难以通过后期纯化去除。  

二、核心灭菌方法

发酵罐灭菌需兼顾灭菌彻-底性与设备耐受性，避免高温、高压对罐体材质（如不锈钢）、传感器（如pH电极）或培养基成分（如维生素、氨基酸）的破坏。以下是主要方法：

1. 蒸汽灭菌（SIP，Steam In Place）——最-常用方法  

原理：利用饱和蒸汽的高温（通常121℃、0.1 MPa，或135℃、0.22 MPa）杀灭微生物（包括芽孢、孢子），通过蒸汽冷凝释放潜热实现热传导灭菌。  

适用场景：空罐灭菌、培养基连消（连续灭菌）、管路系统灭菌。  

操作要点：  

- 空罐灭菌：  

 - 关闭所有进料阀，开启排气阀，通入蒸汽使罐内温度升至121℃，维持30~60分钟（根据罐体容积调整，如50 m³罐需维持60分钟）。  

 - 关键：确保蒸汽穿透所有角落，避免“死角”（如搅拌轴缝隙、喷嘴背侧），可通过热电偶监测罐体不同部位温度差（应＜1℃）。  

- 实罐灭菌（培养基灭菌）：  

 - 培养基直接装入发酵罐，通入蒸汽升温至121℃，维持20~30分钟。  

 - 优点：操作简单，无需额外连消设备；缺点：高温可能破坏热敏感物质（如葡萄糖与氨基酸发生美拉德反应），可通过“分消”（先灭糖，后灭氮源）优化。  

- 连消（连续灭菌）：  

 - 培养基通过板式换热器或连消塔，在135℃、3~5分钟内快速灭菌，随后通入已灭菌的发酵罐。  

 - 优势：灭菌时间短，营养成分保留率高（如维生素损失比实罐灭菌减少50%），适合大规模生产。  

设备要求：  

- 罐体需耐受高温高压（材质为316L不锈钢，耐压≥0.3 MPa）；  

- 配置蒸汽进口、排气口、安全阀及温度/压力传感器，确保灭菌过程可监控。

2. 化学灭菌（消毒）——辅助方法  

原理：利用化学试剂的强氧化性或膜损伤作用杀灭微生物，适用于无法耐受高温的部件或环境。  

常用试剂：  

- 甲醛熏蒸：  

 - 用于空罐灭菌（尤其是玻璃罐或小型试验罐），将甲醛溶液（37%~40%）加热汽化，维持罐内甲醛浓度10~15 mg/L，密封12~24小时。  

 - 缺点：甲醛有毒性，需通风换气48小时以上才能使用，目前逐渐被替代。  

- 过氧乙酸喷雾/擦拭：  

 - 2%过氧乙酸溶液用于罐体内部表面消毒，作用15~30分钟后用无菌水冲洗，适用于局部灭菌（如接种口、取样阀）。  

- 臭氧灭菌：  

 - 通过臭氧发生器产生O₃气体，通入罐内维持浓度≥60 mg/m³，作用30分钟以上，适用于洁净区环境或管路系统灭菌（如配液管道）。  

3. 过滤灭菌——针对气体与液体  

原理：利用微孔滤膜（孔径≤0.22 μm）截留微生物，适用于无法高温灭菌的物料（如血清、酶溶液）或通气系统。  

应用场景：  

- 空气过滤灭菌（好氧发酵核心环节）：  

 - 压缩空气先经粗滤（去除尘埃颗粒）、冷却除水，再通过0.22 μm聚四氟乙烯（PTFE）或尼龙滤膜，确保通入发酵罐的空气无菌（理论过滤效率＞99.9999%）。  

- 液体培养基过滤：  

 - 用于热敏性成分（如维生素C、抗生素溶液），通过深层过滤（如硅藻土过滤）结合膜过滤，例如单克隆抗体生产中，细胞培养液需经0.22 μm滤膜除菌后才能进行纯化。  

4. 辐射灭菌——特殊场景应用  

原理：利用γ射线（如钴-60）或β射线的高能粒子破坏微生物DNA，适用于一次性发酵袋（如50~200 L的Single-Use系统）或塑料配件。  

特点：  

- 无需高温，对材料兼容性好；  

- 灭菌均匀，但需专业辐照装置，成本较高，主要用于生物医药领域。  

三、灭菌效果验证与关键控制点

1. 无菌检测：  

  - 灭菌后取发酵液样本，接种至肉汤培养基，30~37℃培养72小时，观察是否浑浊（杂菌生长迹象）；  

  - 基因工程发酵中需增加支原体检测（如PCR法），确保无隐性污染。  

2. 防止二次污染：  

  - 灭菌后所有操作需在无菌环境下进行（如接种时使用火焰保护，取样采用封闭式取样阀）；  

  - 通气系统的空气过滤器需定期更换（通常每批次或每6个月更换，视使用频率而定），避免滤膜堵塞或破损导致漏菌。  

3. 工艺优化：  

  - 对于含固量高的培养基（如淀粉、黄豆饼粉），需延长灭菌时间或提高蒸汽穿透力（如增加搅拌使物料翻动）；  

  - 采用“脉冲式灭菌”（多次短时间蒸汽冲击）可减少热敏感物质损失，同时保证灭菌效果（如对含糖培养基，121℃灭菌20分钟分两次进行，中间自然降温至100℃以下）。  

发酵罐灭菌是纯种发酵的“生命线”，其核心逻辑是根据物料特性与设备条件选择适宜灭菌组合：  

- 蒸汽灭菌是主流，覆盖罐体、培养基与管路；  

- 过滤灭菌是通气系统的“刚需”，确保无菌空气供应；  

- 化学灭菌与辐射灭菌作为补充，解决高温敏感场景的需求。  

通过“灭菌方法协同+过程监控严格化”，可将杂菌污染概率控制在0.1%以下，保障发酵过程的稳定性与产物质量。